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【南芯paper】JCI (IF12.8):林天歆教授团队发现lncRNA BLACAT2能够促进膀胱癌淋巴管生成和淋巴转移

撰写时间:2018-03-09    来源:广东南芯医疗科技有限公司

近日,中山大学孙逸仙纪念医院林天歆教授团队在国际知名权威期刊TheJournal of Clinical Investigation在线发表了题为“Long noncodingRNA BLACAT2 promotes bladder cancer-associated lymphangiogenesis and lymphaticmetastasis”的研究论文。该研究揭示了膀胱癌淋巴转移的分子机制和提示BLACAT2可能作为临床干预淋巴结转移性膀胱癌的靶标,本研究的芯片数据分析工作由南芯医疗支持

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,许多研究表明,lncRNA的表达或功能异常与人类疾病的发生密切相关,包括癌症、退行性神经疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病。例如,HOTAIR、SChLAP1和BLACAT1通过促进细胞迁移和侵袭调控细胞的转移过程、lncRNA-ATB和LINC01186通过诱导上皮-间质的转化促进癌细胞的转移,但是lncRNA在对细胞转移起着重要作用的淋巴管生成过程的作用机制仍然未知。本研究首先利用芯片杂交技术识别了140例不同组别病人MIBC组织中的差异表达lncRNA,有158个上调的,142个下调,其中,BLACAT2在高级别膀胱癌、淋巴结阳性膀胱癌和淋巴转移阳性肿瘤组织中显著上调。而且这个结果在TCGA数据库中得到了验证。生物信息学分析显示BLACAT2的表达不仅和病例分级严重相关,还和淋巴结的转移程度强相关。此外,高表达BLACAT2的膀胱癌患者具有较短的总体和无转移生存率。这一现象在ISH试验中得到了验证。

图1  BLACAT2过表达与淋巴结转移和膀胱癌预后不良有关(fold changes>2.0, P<0.05)


那么,BLACAT2在膀胱癌中的作用机制是怎样的呢?在接下来的数据统计分析发现,BLACAT2的表达与微淋巴管密度(MVD)显著相关,如在LYVE-1阳性的膀胱癌瘤内(P<0.001)和瘤周(P<0.001)区域,暗示BLACAT2在膀胱癌的淋巴管生成中起重要作用。

图2  BLACAT2与MVD显著相关


因此,接着我们用体内试验证实了这一关系。在裸鼠试验中,我们发现过表达BLACAT2的裸鼠试验中,淋巴标记物LVFE-1的表达显著上调,说明BLACAT能够促进淋巴管的形成,淋巴管形成是淋巴结转移的限速步骤,因此,结果提示BLACAT2促进淋巴结转移。同时,通过Tube formation试验和Transwell试验,我们也在体外验证了BLACAT2能够促进淋巴结转移。

图3  体内试验验证BLACAT2过表达通过促进淋巴管的形成促进膀胱癌细胞的淋巴结转移


图4  体内试验验证BLACAT2过表达促进淋巴管的形成


而癌细胞的转移不仅需要淋巴管的形成,还和细胞的侵袭能力、细胞外基质的降解密切相关。IHC试验、Transwell试验和3D细胞培养试验均显示过表达BLACAT2能够促进膀胱癌细胞的侵袭能力和间质的转化。同时,我们发现尾静脉试验显示过表达BLACAT2扩大了膀胱癌细胞转移定居于肺中的情况。

图5  体内实验表明,BLACAT2过表达促进膀胱癌细胞的侵袭能力和转移能力。


那么,BLACAT2促进膀胱癌细胞中淋巴转移的分子机制是怎样的呢?接下来,我们对沉默了BLACAT2的UM-UC-3细胞系进行了NGS分析。南芯数据分析团队通过NGS发现,1384个基因的表达发生了变化(P<0.05, fold changes>2.0),其中调节淋巴转移的几个重要基因及显著下调:VEGF-C,SNAI2和MMP9。免疫化学试验和qPCR验证了这一变化。同时,数据分析也表明在140例膀胱癌患者中,BLACAT2的表达和VEGF-C,SNAI2,MMP9的水平呈正相关(均为P<0.001)。

图6  BLACAT2调节VEGF-C,SNAI2,MMP9的表达


那么BLACAT2和VEGF-C呈正相关是否通过直接通过作用于VEGF-C的启动子起作用的呢?ChIRP试验和CD技术验证这一点,BLACAT2通过形成三联体与VEGF-C启动子相结合,促进VEGF-C的表达。接着,通过RNApull-down试验,发现BLACAT2直接和WDR5蛋白结合,而WDR5是组蛋白H3K4甲基转移酶复合物的核心组件,提示BLACAT2通过促进VEGF-C启动子的H3K4甲基化从而促进VEGF-C的表达。

图7  BLACAT2通过形成三联体与VEGF-C启动子相结合


图8  BLACAT2用于与WDR5结合的序列


而VEGF-C对于BLACAT2诱导的淋巴管的形成和淋巴结转移是必须的。当VEGF-C被沉默后,BLACAT2诱导的癌细胞的淋巴结转移受到了抑制,提示通过使用VEGF-C抗体可以作为一直潜在的方法治疗BLACAT2过表达的膀胱癌。