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【项目paper】南芯助力首次发现我国1型糖尿病人群的2个可作早期诊断的小分子RNA标记物

撰写时间:2018-04-20    来源:广东南芯医疗科技有限公司

导 读

中山三院内分泌科翁建平教授团队在1型糖尿病(T1DM)领域的研究不断取得新的进展,继在全国同行的支持下完成中国T1DM流行病学研究后,翁教授团队在广东省1型糖尿病转化医学研究取得新的突破性进展:发现了与T1DM早期阶段胰腺β细胞损伤密切相关的小分子RNA,这是在我国1型糖尿病人群第一次发现有临床实用价值的早期诊断标记物,具有重要意义。南芯医疗为翁教授团队提供了专业miRNAs芯片和数据挖掘及分析服务,协助文章发表。


T1DM是一种多基因疾病,其特征在于免疫介导的胰腺β细胞损伤,导致体内胰岛素不足。对β细胞损伤的早期检测可以作为一种提高治疗功效。目前,对β细胞损伤的诊断依据主要是血糖的升高和血浆胰岛素和C-肽的减少。这些参数对识别β细胞受损是很有效,但是只能发生在T1DM确诊后。自身抗体作为参与疾病的早期阶段的免疫过程可以作为T1DM的早期诊断,但其往往不能反映β细胞损伤的程度。未甲基化的胰岛素DNA被认为是诊断B细胞早期损伤的参数,但其在血浆中浓度相对较低而限制了其的使用,而且引起β细胞死亡的机制也会影响未甲基化DNA的释放量。所以,显然需要新的方法来识别早期T1DM患者或正在接受治疗的患者T1DM的病情发展情况。miRNA是一类长度约为22nt的非编码小分子RNA,组织特异性miRNA已经作为一种无创的标记物广泛使用在癌症、免疫性疾病、心血管疾病和2型糖尿病的研究中。miRNAs可以在血清、血浆、尿液和泪液中通过PCR检测得到,而且具有高度的特异性,这使得miRNA可以作为理想的诊断疾病的候选生物标志物。miRNA在β细胞的增殖和凋亡发挥重要的调节功能,但是用作早期诊断T1DM还鲜有报道。在本研究中,我们建立了一个具有很高特异性和敏感性的基于miRNA评估体内和体外的β细胞损伤的模型。

图1  文章研究思路及方法


候选miRNAs的识别-Discovery 队列

为了识别出可用于诊断T1DM的上清中的miRNAs,本文使用了6个新发T1DM的患者和6个健康人群的血清做芯片分析。结果显示,共有27个miRNA显著差异,其中17个在T1DM患者是上调的,10个在T1DM患者中是下调的,根据患者临床特征和前期的研究成果,我们选取6个miRNAs作研究对象,分别是miR-642a-3p,miR-320c, miR-1225-5p, let-7b-5p, miR-26b-5p, and miR-144-3p。

表1  患者临床特征


表2  T1DM患者较健康人群中的差异microRNAs


建立miRNA-based模型-Training 队列

为了测试候选miRNA的价值,我们在40例T1DM新发T1DM患者和56例健康人群中进行qRT-PCR验证。两组的年龄和性别在这一队列中平均分配。结果如图2显示,miR-642a-3p, miR-320c, miR-1225-5p与芯片的结果一致。

图2  6种候选miRNAs qRT-PCR结果


为了建立能够有效用于鉴别T1DM患者的诊断模型,我们应用逻辑回归分析这个队列,评估候选miRNAs用于诊断T1DM的准确率。具体而言,即将六种候选miRNA引入模型中并针对潜在混杂因素(年龄,性别和BMI指数)进行调整。然后这个模型用lilkelihood检验,被发现是显著的。

用ROC分析评估模型的诊断性能。如图3所示,模型的AUC值为0.817(P, 0.001), 高于每个单独的miRNA。

图3  该模型中ROC的曲线分析


用模拟研究评估基于miRNA的过拟合模型,最高的AUC值(P值)为0.801(0.001)。另外,一次性交叉验证验证了训练队列中的T1DM,由此导致的错误率为18.3%,这表明该模型具有良好的稳定性和可靠性。

验证该miRNA-based模型-Validation 队列

该模型在另一个队列中进行了验证,其中包括33例新发T1DM患者和29例健康人群。模型的参数用于预测T1DM发生的概率,预测性概率用于构建ROC曲线。如图4所示,模型的AUC值是0.804(P,0.001),当Youden指数达到最大值时,对应的而敏感型,特异性,阳性预测率和阴性预测率分别为87.9%,69.2%,78.4% 和81.8%。

图4  验证队列中的ROC分析


体外和体内试验验证

在STZ处理INS-1细胞系试验中,miR-1225-5p和miR-320c的水平显著上调。

图5  STZ处理后,INS-1 细胞中miR-1225-5p和miR-320c的水平显著上调


NOD小鼠中,在葡萄糖升高处理前,miR-1225-5p和miR-320c的水平也显著上调。

图6  NOD小鼠上清中miR-1225-5p and miR-320c的水平显著上调


分别通过对三种队列进行miRNAs芯片分析,筛选出miR-1225-5p和miR-320c作为和胰腺β细胞损伤有关的分子标记物,这是我国第一次发现在1型糖尿病人群中有临床使用价值的早期诊断标记物。